Генетическая экспертиза митохондриальной ДНК

Генетическая информация играет ключевую роль в формировании роста, развития, структуры, обмена веществ и психоэмоциональных характеристик человека. Эта информация закодирована в ДНК, которая присутствует не только в ядре клетки, но также и в органеллах, таких как митохондрии, отвечающих за преобразование химической энергии из пищи в формы, необходимые для клетки. Эта ДНК называется митохондриальной.

Митохондрии выполняют функцию "энергетических станций", без которых клетка не может существовать. Они содержат собственный генетический материал, представленный митохондриальной ДНК. Предполагается, что изначально митохондрии были бактериями, но после внедрения в эукариотические клетки они потеряли часть своей генетической информации, передав её в ядро клетки-хозяина. В результате митохондриальная ДНК состоит всего из 37 генов, необходимых для окисления глюкозы до углекислого газа и воды, а также для синтеза клеточного "топлива" — АТФ (аденозинтрифосфата) и НАДН (восстановленного никотинамидадениндинуклеотида).

Передача митохондриальной ДНК происходит от матери к детям, от дочерей к внукам. Почему так происходит, и почему мы не можем унаследовать её от отца?

Яйцеклетки содержат значительно больше митохондрий, чем сперматозоиды, которые нуждаются в митохондриях лишь для своего движения. В процессе оплодотворения сперматозоид проникает в яйцеклетку, зачастую теряя жгутик и митохондрии, расположенные в его основании. После слияния сперматозоида с яйцеклеткой формируется зигота, однако митохондрии сперматозоида, помеченные убиквитинином, разрушаются ооцитом, а ядро сперматозоида объединяется с ядром яйцеклетки, инициируя новый жизненный цикл.

Митохондриальная ДНК наследуется исключительно по материнской линии: как мужчины, так и женщины получают митохондрии из цитоплазмы яйцеклетки матери. Эти небольшие двуспиральные молекулы ДНК имеют давнюю историю, восходящую к "митохондриальной Еве", которая является общим предком всех живущих людей по материнской линии. В то время как ядерная ДНК, состоящая из 46 хромосом, наследуется от обоих родителей (по 23 хромосомы от каждого), митохондрии и мтДНК ребенок получает только от матери. Благодаря этому митохондриальная ДНК становится идеальным объектом для генетических экспертиз, направленных на установление родственных связей по материнской линии. В отличие от полиморфизмов длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ), используемых для установления отцовства, генетическая экспертиза митохондриальной ДНК сосредоточена на выявлении индивидуальных точечных нуклеотидных изменений. Гены в митохондриальной ДНК расположены очень плотно, и хотя в ней недостаточно тандемных повторов, она "насыщена" точечными мутациями, что обеспечивает её высокую вариабельность. Эти мутации выявляются и анализируются с использованием современных секвенаторов при исследовании митохондриальной ДНК.

Митохондриальная ДНК обладает рядом уникальных свойств, которые отличают её от ядерной:

мтДНК не подвергается рекомбинации, изменяясь только в результате мутаций на протяжении тысячелетий;
наследуется исключительно по материнской линии;
может быть выделена из любого биологического материала;
благодаря множественным копиям мтДНК, она может быть единственным доступным источником ДНК, особенно при сильно деградированной ядерной ДНК или дефиците биологического материала;
высокий уровень мутаций в мтДНК по сравнению с одной копией ядерной ДНК повышает точность идентификации в рамках генетической экспертизы.

Когда требуется проведение генетической экспертизы митохондриальной ДНК (МТДНК)?

Для установления родства между двумя женщинами или женщиной и мужчиной, касающемся предполагаемых родственников по материнской линии. Это может включать такие связи, как дедушка/бабушка с внуком, дядя/тётя с племянником, брат с сестрой.
При исследовании очень малых объемов биологического материала. В каждой клетке может содержаться от 100 до 10,000 копий мтДНК, тогда как ядерной ДНК всего лишь две копии для каждой из 23 хромосом.
В случае анализа старых образцов, возраст которых может достигать десятилетий, столетий или даже тысячелетий. Например, благодаря мтДНК были идентифицированы останки членов семьи Романовых.
Когда отсутствует другой генетический материал, например, когда есть всего один волос. Хотя стержень волоса содержит минимальное количество ядерной ДНК, он является прекрасным источником митохондриальной ДНК.
Для определения генетической принадлежности конкретной гаплогруппы (например, европейской, африканской, ближневосточной или американской), что помогает установить происхождение человека.

Какие материалы необходимо предоставить для генетической экспертизы митохондриальной ДНК?

Митохондриальная ДНК находится в каждой клетке организма, включая клетки, не содержащие ядро (например, тромбоциты, эритроциты и клетки волос). Для анализа мтДНК подходят ткани организма, такие как кости, зубы, кровь, сперма и остатки скелетированных тел. Обычно, для проведения экспертизы (например, для установления отцовства или материнства) собирают образцы буккального эпителия (соскобы из щеки), каплю крови с пальца (0,3-0,5 мл), кровь на ватном диске, волосы или ногти. Забор тканей должен осуществляться в соответствии с законодательством, включая Федеральный закон "О государственной судебно-экспертной деятельности в Российской Федерации" и приказ Минздравсоцразвития РФ о порядке проведения судебно-медицинских экспертиз.

Полученные образцы направляются генетикам в специализированные лаборатории, где выполняется трехступенчатый анализ:

извлечение мтДНК.
амплификация определенного участка мтДНК.
определение первичной последовательности нуклеотидов этого участка.

На первом этапе эксперты извлекают ДНК из исходного материала, что является довольно сложным процессом, занимающим до 24 часов. Например, извлечение мтДНК из крови занимает приблизительно два часа, тогда как лизирование ткани волос или ногтей может требует до 12 часов с использованием специальных ферментов. Обычно применяются коммерческие реактивы от известных мировых производителей, таких как Applied Biosystems, Promega и QIAGEN.

На втором этапе выполняется полимеразная цепная реакция (ПЦР), в ходе которой участок мтДНК (D-петля) многократно увеличивается. Анализ нуклеотидной последовательности D-петли является ключевым для исследования мтДНК, поскольку её вариабельность позволяет выявлять индивидуальные особенности. Каждый человек имеет уникальный участок D-петли, унаследованный по материнской линии, что объясняется различиями, возникающими из-за мутаций. Эти уникальные свойства делают D-петлю специфичной для каждого отдельного индивидуума.

На следующем этапе производится очищение увеличенного фрагмента митохондриальной ДНК и его секвенирование. Секвенирование подразумевает определение первичной нуклеотидной последовательности ДНК, то есть, расшифровку уникального для каждого организма генетического кода. Эксперт сопоставляет нуклеотидные последовательности D-петли из разных образцов, чтобы определить их соответствие и сравнить с референтной последовательностью мтДНК. Для вычисления несовпадений нуклеотидов (мутаций) в ДНК применяется статья 3.6 Методических указаний Минздрава РФ №2001/4 от 25.01.2001 года "Применение молекулярно-генетической индивидуализирующей системы на основе полиморфизма нуклеотидных последовательностей митохондриальной ДНК в судебно-медицинской экспертизе идентификации личности и установлении биологического родства". В заключениях генетической экспертизы мтДНК указывается вероятность совпадения признаков в процентном выражении.

Все результаты тестирования мтДНК сопоставляются с так называемой "стандартной кембриджской последовательностью". Это первая расшифрованная нуклеотидная последовательность митохондриальной ДНК, работы по которой проводились в 1981 году в Кембридже Стеном Андерсеном; эта последовательность также известна как "последовательность Андерсена". Она стала международным стандартом, от которого отсчитываются все мутации в анализируемой последовательности. Сравнивая нуклеотидные последовательности исследуемой мтДНК со стандартной кембриджской последовательностью, эксперты устанавливают генетический профиль, определяя индивидуальные генетические характеристики.

На основе генетического профиля специалисты определяют принадлежность изучаемой митохондриальной ДНК к определённой расе или гаплогруппе, и соответственно – к какому человеку она относится. Таким образом, генетическая экспертиза митохондриальной ДНК может быть использована для создания ДНК-генеалогии и в некоторых случаях для предположения о внешности человека. В то время как в исследованиях Y-хромосомы ученые пытаются найти предполагаемого Адама, по генетическому профилю мтДНК можно определить предполагаемую Еву.

Задачи генетической экспертизы митохондриальной ДНК

Наличие совпадений нуклеотидных последовательностей мтДНК у изучаемых биологических образцов. Для этого сравниваются индивидуальные профили полиморфизма анализируемых участков ДНК в соответствии с установленными правилами, с целью идентификации или нахождения сходств и различий, а также для установления фактов, имеющих доказательственное значение.
Если найдено совпадение признаков, определяется вероятность того, что это совпадение является реальным, а не случайным.

Нормативно-правовая база для проведения генетической экспертизы митохондриальной ДНК

Федеральный закон от 31 мая 2001 года № 73-ФЗ "О государственной судебно-экспертной деятельности в Российской Федерации"
Приказ Минздравсоцразвития РФ № 346н от 12.05.2010 года "Об утверждении Порядка организации и проведения судебно-медицинских экспертиз"
Методические указания Минздрава РФ № 2001/4 от 25.01.2001 года "Применение молекулярно-генетической индивидуализирующей системы на основе полиморфизма нуклеотидных последовательностей митохондриальной ДНК в судебно-медицинской экспертизе идентификации личности и установлении биологического родства"
Семейный кодекс РФ, Глава 10 "Установление происхождения детей".

Вопросы эксперту

Является ли Ф.И.О., дата рождения, биологическим отцом Ф.И.О., дата рождения, мать которой — Ф.И.О., дата рождения?
Исключается ли биологическое отцовство Ф.И.О., дата рождения, в отношении Ф.И.О., дата рождения? Если отцовство не исключается, какова вероятность того, что результат не является следствием случайного совпадения индивидуализирующих признаков у неродственных лиц?
Является ли Ф.И.О., дата рождения, умерший дата в ..., отцом несовершеннолетнего Ф.И.О., дата рождения, мать которой — Ф.И.О., дата рождения?

Важно! Приведённый список вопросов не исчерпывающий. Перед проведением экспертизы рекомендуется проконсультироваться с экспертом в случае возникновения дополнительных вопросов.

Основание для проведения экспертизы

Экспертиза проводится на основании:

договора с юридическим или физическим лицом;
судебного определения или постановления;
постановления дознавателя или следователя;
постановления налогового инспектора;
постановления нотариуса;
постановления дознавателя таможни;
в рамках государственных закупок.

Типы экспертиз

Единоличная — проводится одним экспертом.
Комиссионная — проводится группой экспертов одной специальности. Назначается при сложных случаях и повторном исследовании.
Комплексная — проводится с привлечением экспертов разных специальностей, для установления наиболее точных причин произошедшего.

Основные требования к эксперту

Чтобы гарантировать объективность исследования, эксперт обязан сохранять независимость от сторон, вовлечённых в спор. Если в ходе судебного процесса выявится предвзятость или необъективность эксперта, его участие будет прекращено, а заключение признано недопустимым доказательством по делу, затем будет назначена новая экспертиза.

Эксперт должен обладать высшим образованием в соответствующей области или пройти дополнительную подготовку по экспертной специальности.

Консультация эксперта

На предварительной консультации эксперт уточняет главную цель экспертизы, объясняет возможные выводы и используемые методики экспертизы, а также определяет в договоре объект экспертизы.

Все экспертизы проводятся с учетом принципов всесторонности, объективности и полноты исследований. Эксперты могут выявить недостатки в заключениях, подготовленных другими организациями, и составить критическую рецензию, выделяя методические и процессуальные ошибки в ходе выполнения экспертизы.

Проведение рецензирования

Если суд принял решение на основе необъективной и сомнительной экспертизы, можно заказать рецензирование.

Наши эксперты помогут выявить методические или процессуальные ошибки, если есть сомнения в достоверности выводов, сделанных другой организацией. Результатом станет подготовленное заключение в форме рецензии.

Всякая экспертиза проводится в соответствии с критериями всесторонности исследования, с использованием современных технологий и участием квалифицированных экспертов.